Opmerking: Dit is exact dezelfde tutorial als gepubliceerd op 25 maart 2015, behalve dat het nu gebaseerd is op FoldX4. De reden is dat we de FoldX licentie elk jaar moeten updaten (van 31 December tot 1 januari). Dit betekent dat als je banen Run tijdens de kerstvakantie, de banen worden gedood op oudejaarsavond. En het probleem is dat ze verschoven van release 3 naar 4, die gepaard ging met een volledige verandering in de interface. Dat is goed, want het is nu veel eenvoudiger.
zij hebben ook enkele wijzigingen aangebracht in de energieberekening door enkele parameters toe te voegen, maar dit is nog niet gedocumenteerd. Dus als je je project gestart hebt met FoldX3, en je moet FoldX opnieuw gebruiken, is het misschien beter om FoldX4 opnieuw uit te voeren op je hele dataset, om redenen van coherentie.
tot slot, zoals gewoonlijk, als u vragen of opmerkingen heeft, bent u welkom!
———-
Inleiding:
hier is een korte handleiding over het gebruik van FoldX om het stabiliteitseffect van een mutatie in een 3D-structuur in te schatten. De stabiliteit (ΔG) van een eiwit wordt bepaald door de vrije energie, die wordt uitgedrukt in kcal/mol. Hoe lager het is, hoe stabieler het is. ΔΔG is het verschil in vrije energie (in kcal / mol) tussen een wild-type en een mutant. Een mutatie die energie brengt (ΔΔG > 0 kcal / mol) zal de structuur destabiliseren, terwijl een mutatie die energie verwijdert (ΔΔG < 0 kcal/mol) de structuur zal stabiliseren. Een veel voorkomende drempelwaarde is dat een mutatie een significant effect heeft als ΔΔG >1 kcal / mol is, wat ruwweg overeenkomt met de energie van een enkele waterstofbinding.

een goede manier om de vrije energie te berekenen is door moleculaire dynamica te gebruiken. Belangrijkste probleem: het kan zeer tijdrovend zijn.
FoldX gebruikt een empirische methode om het stabiliteitseffect van een mutatie te schatten. Het uitvoerbare bestand is hier beschikbaar: http://foldxsuite.crg.eu/
u moet zich registreren, maar het is gratis voor academici.
NB: ik moedig ten zeerste aan om de handleiding te lezen (voor of parallel aan deze handleiding).

manueel: http://foldxsuite.crg.eu/manueel # manueel
FoldX werd in vele studies gebruikt, d.w.z.:

Tokuriki N, Stricher F, Serrano L, Tawfik DS. Hoe eiwit stabiliteit en nieuwe functies af te wisselen. PLoS Comput Biol. 2008 Feb 29; 4(2): e1000002 http://dx.doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000002
Dasmeh P, Serohijos AW, Kepp KP, Shakhnovich EI. Positief geselecteerde plaatsen in walvisachtige myoglobinen dragen bij tot eiwitstabiliteit. PLoS Comput Biol. 2013; 9 (3): e1002929. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002929

en ik persoonlijk gebruikte het in drie van mijn studies:

Studer RA, Christin PA, Williams MA, Orengo CA. Stability-activity tradeoffs beperken de adaptieve evolutie van RubisCO. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 11 Feb;111(6):2223-8. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1310811111

Studer RA, Opperdoes FR, Nicolaes GA, Mulder AB, Mulder R. Inzicht in het functionele verschil tussen groeistilstand-specifiek proteïne 6 en proteïne S: een evolutionaire benadering. Open Biol. 2014 okt; 4 (10). pii: 140121. http://dx.doi.org/10.1098/rsob.140121
Rallapalli PM, Orengo CA, Studer RA, Perkins SJ. Positieve selectie tijdens de evolutie van de bloedstollingsfactoren in de context van hun ziekteverwekkende mutaties. Mol Biol Evol. 2014 Nov; 31 (11): 3040-56. http://dx.doi.org/10.1093/molbev/msu248

Tutorial voorbeeld:
de structuur is een bacterieel cytochroom P450 (PDB:4TVF). U kunt het PDB-bestand downloaden (4TVF.pdb) vanaf hier: http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=4TVF
of rechtstreeks met wget:

wget http://ftp.rcsb.org/download/4TVF.pdb

we willen de stabiliteit van de mutatie op positie 280 testen, van een leucine (L) tot een asparaginezuur (D). Hier is de oorspronkelijke structuur, met Leu280 in het groen, en residuen rond 6Å in het geel:

FoldX werkt in twee stappen:
1) Herstel de structuur.
er zijn vaak problemen in VOB-structuren, zoals sterische botsingen. FoldX zal proberen ze te fixeren en de globale energie (ΔG) verlagen. De opdracht ” RepairPDB “is beter dan de opdracht” optimaliseren”. Hier is hoe FoldX te starten:

foldx — command = RepairPDB –pdb=4TVF.pdb –ionStrength = 0,05 –pH = 7 — water = CRYSTAL –vdwDesign=2 –outdb=true –pdbHydrogens=false

we geven aan welk PDB-bestand het moet gebruiken, dat we het willen repareren (RepairPDB), dat het water en metaalbindingen van het PDB-bestand zal gebruiken (–water=CRYSTAL) en dat we een PDB als uitvoer willen (–outdb=true). Alle andere parameters zijn standaard.
dit proces is vrij lang (ongeveer 10 minuten). Hier is het resultaat (de originele structuur is nu in het wit, terwijl de gerepareerde structuur is in geel / groen):

we kunnen zien dat sommige zijkettingen licht zijn verschoven (in het bijzonder Phe16).
de beginnende vrije energie ΔG was + 73,22 kcal / mol en werd verlaagd tot -46,97 kcal/mol, wat nu stabiel is (onthoud dat een “+” teken instabiel betekent, terwijl een “-” teken stabiel betekent).
zodra het klaar is, zal het een bestand met de naam “4TVF_Repair produceren.pdb”, die u zult gebruiken in de volgende stap.

2) de mutatie uitvoeren
de mutatie zelf wordt uitgevoerd door de BuildModel-functie. Er zijn andere methoden, maar het BuildModel is blijkbaar de meest robuuste (ik zei blijkbaar, maar er zijn geen goede benchmarks ten opzichte van de andere methode PositionScan of PSSM). Je moet ook de mutatie specificeren in een apart bestand “individual_list.txt”. Hier is het bestand “individual_list.txt” (Ja, slechts één regel):

LA280D;

het bevat het beginnende aminozuur (L), de keten (a), de positie (280) en het gewenste aminozuur aan het einde (D). Eén regel komt overeen met één mutant. Het betekent dat je veel residuen kunt muteren op hetzelfde per lijn (mutant) en ook verschillende mutanten produceren door verschillende aantallen lijnen.
in de volgende opdrachtregel ziet u dat 4TVF_Repair is.VOB en niet 4TVF.pdb dat is gemuteerd. U zult ook merken “– numberOfRuns = 3”. Dit komt omdat sommige residuen veel rotamers kunnen hebben en sommige convergentieproblemen kunnen hebben. U kunt deze waarden verhogen tot 5 of 10, in het geval u lange residuen (bijv. Arginine) muteert die veel rotameren hebben.
u kunt het uitvoeren met:

foldx — command=BuildModel –pdb = 4TVF_Repair.pdb — mutant-file = individual_list.txt — ionStrength = 0,05 –pH = 7 — water = CRYSTAL — vdwDesign = 2 –outdb = true –pdbHydrogens = false –numberOfRuns = 3

het is deze keer veel sneller (dus een paar seconden) en zal veel bestanden produceren.
FoldX zal eerst het doelresidu (L) muteren in zichzelf (L) en het evenals alle naburige zijketens meerdere keren verplaatsen. We kunnen zien dat Leu280 (groen) werd gedraaid:

=> dit geeft de vrije energie van het wild-type (Laten we het ΔGwt noemen).
vervolgens muteert het het doelresidu (L) naar de gewenste mutant (D) en verplaatst het samen met alle naburige zijketens meerdere keren. We kunnen zien dat Leu280 is gemuteerd naar Asp280 (zie de twee zuurstofatomen in rood):

=> dit zal de vrije energie van de mutant geven (Laten we het ΔGmut noemen).
het verschil in vrije energie (ΔΔG) wordt gegeven door ΔGmut-ΔGwt.
In het bestand ” Raw_4TVF_Repair.fxout”, kunt u de energie van de drie runs voor zowel WT en Mutant.
Run1:

  • ΔGmut = 4TVF_Repair_1.pdb = -42.7114 kcal / mol
  • ΔGwt = WT_4TVF_Repair_1_0.pdb = -47,6248 kcal / mol
  • => ΔΔG = ΔGmut-ΔGwt = (-42.7114)-(-47.6248) = +4.9134 kcal / mol

een bestand bevat het gemiddelde verschil over alle runs: “Average_4TVF_Repair.fxout”.
(u zult merken dat het verschil in vrije energie ΔΔG +4,85 kcal/mol is ).
= > het betekent dat de mutatie L280D zeer destabiliserend is (positieve waarde, en veel boven 1,0 kcal/mol).
PS: een manier om de drempelwaarde te definiëren is de standaarddeviatie (SD) te gebruiken met meerdere:
de gerapporteerde nauwkeurigheid van FoldX is 0.46 kcal / mol (d.w.z. de SD van het verschil
tussen ΔΔGs berekend door FoldX en de experimentele waarden). We kunnen bin de ΔΔG waarden in zeven categorieën:

  1. zeer stabiliseren (ΔΔG < -1.84 kcal/mol);
  2. stabiliseren (-1.84 kcal/mol ≤ ΔΔG < -0.92 kcal/mol);
  3. enigszins te stabiliseren (-0.92 kcal/mol ≤ ΔΔG < -0.46 kcal/mol);
  4. neutraal (-0.46 kcal/mol < ΔΔG ≤ +0.46 kcal/mol);
  5. iets destabiliserende (+0.46 kcal/mol < ΔΔG ≤ +0.92 kcal/mol);
  6. destabiliserende (+0.92 kcal / mol < ΔΔG ≤ + 1,84 kcal/mol);
  7. zeer destabiliserend (ΔΔG > +1,84 kcal / mol).